STAR Protocols︱苏文如/郑颖丰团队发表基于高维质谱流式的人类血液免疫细胞功能分析的实验方案

撰文︱吕健阶，刘秀兴

责编︱王思珍

制版︱查佳雪

在免疫性疾病的临床和基础研究中，人类来源的血液样本是重要的非侵入性临床样本，能够较好反映健康人和患者群体的系统免疫状态。近些年来，凭借高分辨率和高维度的优势，质谱流式细胞技术（mass cytometry）在炎症疾病、肿瘤、干细胞治疗、疫苗开发等领域得到广泛的应用[1]。凭借质谱流式这项单细胞技术，人们可以同时分析每个细胞的多达40种标记物的蛋白水平，从而分析临床血液样本中复杂的免疫细胞组成和功能改变。然而，临床样本采集往往跨度时间较长，单一样本处理存在染色和数据获取的差异性，这可能导致样本间批次效应的产生，从而掩盖真实的生物学结果。另外，血液细胞质谱流式测序结果的高维分析仍存在难点。

2022年4月8日，中山大学中山眼科中心苏文如研究组、郑颖丰研究组在Cell子刊STAR Protocols杂志在线发表了题为“Functional analysis of human circulating immune cells based on high-dimensional mass cytometry”的实验方案文章（Protocol）。该文章提出和展示了一个经过优化和验证的质谱流式实验和分析流程，旨在在单细胞蛋白水平对人类血液免疫细胞的因子分泌功能进行测定和分析。该工作流程优势在于临床样本固定后蛋白染色以及优化后的条形码染色模式。此工作流程中使用的试剂和方法有助于减少临床样本批次效应，精确进行高维层面的功能分析，从而扩大质谱流式细胞仪的应用范围和优势。苏文如研究组、郑颖丰研究组自2020年以来，已运用本研究流程进行了衰老、新冠肺炎、熬夜等领域的研究，发表质谱流式相关文章4篇[2-5]。

在既往研究的基础上，研究者详细阐述了质谱流式测序的实验和分析的相关流程，包括金属/抗体标记、抗体浓度滴定、血液样本中PBMC的分离、细胞的不同处理、细胞的活率测定、细胞固定和冻存、表面蛋白染色、条形码标记、细胞内蛋白染色、细胞核染色、上机获取、数据清洗和后续数据分析，并展示了刺激前后两组的因子分泌情况（图1）。除了详细的试剂和方法，本方案也提供了详细的37种抗体来检测人类血液免疫细胞的表型和功能。因此，不同的抗体组合可以应用于其他细胞类型的功能分析。

图1 刺激前后细胞内因子表达的测定

（图源：Liu X, et al., STAR Protoc, 2022）

在实验过程中如何减少样本间批次效应是一个重要的问题。研究者围绕临床血液样本收集时间跨度长、染色时间久等情况，对质谱流式测序的实验流程进行了优化。由于每一批次常常只有2-3个样本，而细胞固定对于细胞保存以及随后的细胞表面和细胞内染色非常重要，因此研究者采用了“死活标记-细胞固定-冻存液保存”的保存模式。当收集到足够的临床样本，并准备好抗体和试剂后，就可以进行后续的蛋白染色和数据获取。另外，由于染色和上机过程长达10余个小时，这些操作可能会放大样本间的误差，产生批次效应。因此研究者引入了条形码标记方法，每个样本先标记条形码后，通过同组样本等量混合形成单一标记样本（barcoded group），之后进行每个标记样本的染色和上机过程。以往研究报道条形码标记会影响表面蛋白的染色，因此这一步骤往往放在表面染色之后进行。研究者进一步改进和优化了条形码标记模式，即先预实验鉴定出受条形码影响的表面蛋白，如CCR4, CCR7（图2），之后进行“表面染色-条形码标记-表面染色”的染色过程，从而更好地减少样品误差，并在保证准确染色的基础上优化实验过程。

图2 预实验鉴定出受条形码标记影响的表面蛋白

（图源：Liu X, et al., STAR Protoc, 2022）

质谱流式测序技术继承了传统流式细胞术的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，但是质谱流式数据的后续高维分析仍然是个挑战。在本实验流程中，研究者详细地展示了上机获取数据后的数据清洗和后续数据分析。在数据分析前，研究者通过圈门消除EQ Beads 和 Gaussian 计算的影响、消除死细胞和碎片，从而获得活的单细胞群体。对于高维的数据分析，研究者详细地展示了数据整合、聚类和分群所需要的算法和步骤。值得注意的是，研究者发现真实的生物学结果往往被各种因素所混淆，比如实验所使用的细胞刺激剂。刺激剂能激活细胞内相关信号通路，促进细胞因子的表达，从而达到流式细胞检测的水平。但是，实验条件不同导致的蛋白表达不同往往导致高维聚类和分群的结果产生差异。研究者发现，本实验使用的细胞刺激剂能显著增强细胞活化标记物CD69表达和降低CCR2表达。通过对比不同蛋白组合的高维分析结果，研究者发现使用不含CD69和CCR2的组合进行聚类分群，两组间细胞群体融合较好，分群结果准确（图3）。因此，需要充分考虑和选择用于后续高维分析的标记物组合，这样才能保证正确的免疫细胞分群，从而在单细胞分辨率下实现高维分析。

图3 质谱流式高维生信分析结果

（图源：Liu X, et al., STAR Protoc, 2022） 

图4 质谱流式方案流程图

（图源：Liu X, et al., STAR Protoc, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，在这项工作中，研究者系统地描述了质谱流式测序的实验流程和分析方法，提供了详细的试剂和方法来检测人类血液免疫细胞的表型和功能（图4）。该研究改进了基于高维质谱流式测序技术的人类血液免疫细胞功能分析的实验方案，通过临床样品固定冻存后统一进行染色和优化条形码标记策略，从而减少样本间的染色误差和批次效应，有助于扩大质谱流式测序技术的优势和应用范围。研究者系统描述了质谱流式数据的高维生物信息学分析方法和流程，并提出了新的解决方案，即合理选择用于聚类分群的标记物组合，从而精确进行高维层面的功能分析。该研究方案还提供了实验过程中可能出现的问题的解决方案，可以作为后续使用质谱流式测序过程中的重要参考。值得注意的是，该方案对检测人类血液免疫细胞组成和功能进行了优化，所以其是否适用于其他样本和免疫类型还需要进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2022.101310

据悉，中山大学中山眼科中心苏文如教授、郑颖丰教授为共同通讯作者。中山大学中山眼科中心博士研究生刘秀兴为第一作者，其他合作者包括硕士研究生吕健阶、王惠诗。研究得到了国家杰出青年科学基金项目和国家重点研发计划项目的资助，同时也感谢研究小组工作人员提供的技术援助与合作。

苏文如 教授

（照片提供自中山大学中山眼科中心苏文如实验室）

通讯作者简介（上下滑动阅读）  

苏文如，教授，主任医师，博士研究生导师。“国家优青”基金获得者，“广东省杰青”基金获得者，2020年中国眼科学术影响力百强榜排名67。临床上擅长葡萄膜炎等各种眼免疫性疾病和眼底疾病的诊断和治疗。主持国自然优秀青年基金，国家重点研发计划课题等多项国家级基金。目前主要研究方向为眼科免疫炎症性疾病的基础及临床研究，近年来在PNAS、Cell Death Differ、J Allergy Clin Immunol、Protein & cell、Cell Discovery、J Immunol、IOVS等SCI杂志发表70余篇学术论文。获广东省科技进步一等奖1项，授权发明专利3项。如有兴趣申请苏教授实验室博士后，请发Email至：[e-mail]，具有眼免疫学和生物信息学背景者优先。

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参考文献（上下滑动阅读）  

[1]Spitzer MH, Nolan GP. Mass Cytometry: Single Cells, Many Features. Cell. 2016. 165(4): 780-91.

[2]Liu X, Lv J, Wang H, Zheng Y, Su W. Functional analysis of human circulating immune cells based on high-dimensional mass cytometry. STAR Protoc. 2022. 3(2): 101310.

[3]Liu X, Chen B, Huang Z, et al. Effects of poor sleep on the immune cell landscape as assessed by single-cell analysis. Commun Biol. 2021. 4(1): 1325.

[4]Shi W, Liu X, Cao Q, et al. High-dimensional single-cell analysis reveals the immune characteristics of COVID-19. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2021. 320(1): L84-L98.

[5]Zheng Y, Liu X, Le W, et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 2020. 11(10): 740-770.

本文完